疑難解析 | 2023年度直播答疑熱點匯總

血清成份復雜，里面包含抑制分化的因子，也包含促進分化的因子；間充質干細胞一類成體干細胞大多可以用血清培養，單能干細胞，用血清不會分化；胚胎干會細胞分化。

血清的刺激分化主要與血清品質相關，品質高的可以維持干細胞增殖，抑制分化；品質較低的如新生牛血清會誘導分化；與生產批次也有關系，不同批次因子含量不一，分化效果不一。

? 篩選品質高的血清批次；

? 添加抑制分化的因子，如bFGF，EGF等；

? 及時傳代，控制密度，刺激增殖，高密度會引起分化；

? 及時換液，防止代謝累積，刺激分化；

? 控制培養基質量如內毒素、支原體、pH等等，控制環境穩定。

細胞密度高的時候，消化3~4 min 才能完-全消化下來，細胞高密度下生長速度快，低密度下細胞增殖慢甚至死亡，建議傳代比例控制在1:2~1:4，不要超過1:4。

細胞分化了之后是不會再增殖的。細胞分化實驗前期，細胞還能緩慢增殖，但隨著實驗的進展，漂浮的細胞越來越多，這時候要分不同的情況處理：

? 如果實驗前，細胞長得過滿，可能因為接觸抑制產生較多漂浮細胞。這種情況下，只要貼壁的細胞沒有受到影響，實驗可以繼續；

? 另一種情況，是實驗開始時的密度合適，實驗開始后，貼壁的細胞慢慢脫落漂浮，這種情況是不正常的，需要結合實驗前細胞狀態、實驗所用的誘導試劑對細胞的影響等多方面的因素去調整。

正常培養的細胞系是沒有梯度離心這個概念的，梯度離心通常是用于細胞提取時，多種細胞混合在一起的一種分離措施。懸浮細胞培養的過程中會始終伴隨著細胞的死亡，細胞死亡后裂解就會產生碎片。這種可以通過低速離心（800 rpm，3~5 min）去除一部分，但無法完-全去除。

懸浮細胞需要計數來判斷。貼壁細胞可以看不同視野下細胞的密度，以大多數視野下的密度為準。需要注意的是，不是所有細胞都會平鋪單層，有些細胞可能會堆疊生長，比如Hep G2。

THP-1是一類單核細胞，可以在特定的情況下分化為M0型的巨噬細胞，這時的細胞就是會貼壁的。培養的過程中如果發現細胞出現了貼壁的情況，傳代的時候可以只收集漂浮的細胞。同時排查實驗室的環境、培養基、血清等，看看有沒有什么特定的影響因素導致細胞貼壁。

細胞培養傳代次數多了，會存在狀態越來越差的情況?？梢栽诩毎麪顟B好的時候，一邊傳代，一邊凍存。NK-92細胞有很強的IL-2依賴性，培養時要注意避免過度吹打，團塊吹散的同時，細胞也容易受損。培養過程中，一方面需要注意及時添加IL-2，一方面也需要注意吹打次數，一般輕輕吹2~3下將大團吹成小團就可以了。

需要結合具體的細胞及圖片具體分析。如果是一些有成脂能力的細胞，不排除是細胞培養的過程中受到某種刺激分化形成了脂滴。除此以外，還需要排除器皿本身的影響。最后結合顯微鏡下的圖片及視頻進行判斷，看是否有明顯微生物的痕跡。如果上述方法都無法判斷，必要時，可以收集細胞培養液置于37℃培養箱進行空培養，觀察是否有明顯的微生物增殖。

細胞復蘇后老化，可能是因為細胞凍存前的狀態不佳，以及凍存時的保存活性效果不好，這些都會影響細胞狀態，其中凍存損傷影響比較常見。建議控制凍存前狀態、控制凍存過程及凍存液確保細胞活率。

一般誘導效果好，脂滴大，相差顯微鏡白光可以觀察到油滴，可能會存在誤判，建議使用標準檢測方法，用油紅O染色方法鑒定。

懸浮細胞通常是當天按實驗所需細胞量接種細胞，后續配置轉染復合物，將轉染復合物滴加到培養基中，根據摸索好的轉染時間，收樣檢測。

設置好分組，空白對照、陰性對照、陽性對照、DNA、siRNA、DNA和siRNA共轉染（用無血清培養基稀釋DNA和siRN及DNA，無血清培養基稀釋轉染試劑），摸索適宜的濃度、比例、轉染時間。

大多數懸浮細胞培養時都會聚團，還有些懸浮細胞本身就是聚團長的，不聚團說明細胞活性較差，如NK-92細胞。培養本身是聚團生長的懸浮細胞，是不可以減少細胞團的。如果是存在少數聚團，大部分單顆懸浮的細胞，可以將細胞進行高密度培養.一般密度在200萬/mL時，細胞大部分是單顆分散的。

這是一株對營養要求較高的懸浮細胞，培養的時候需要添加β-巰基乙醇。如果細胞剛復蘇就生長緩慢，可以先用臺盼藍染色檢測細胞的活性。如果是復蘇時生長狀態較好，但傳代后生長緩慢，可能是培養基的營養不夠，比如沒有加β-巰基乙醇等。另外，細胞不增殖可能與接種時的密度太低有關。懸浮細胞培養是有密度要求的，一般情況下密度控制在50-200萬/mL為佳，密度太低了，細胞增殖緩慢，密度太高了，細胞可能會慢慢裂解死亡。